非鏈特異性轉錄組測序

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非鏈特異性轉錄組測序

轉錄組（transcriptome）在廣義上是指細胞內全部轉錄產物的集合，狹義上是指細胞中所有轉錄本（mRNA）的集合。轉錄組測序通常來說是指依託於高通量測序平台對細胞中的mRNAs進行測序。經過資訊的整理和分析，可在不同的樣本中挖掘具有意義的差異表達基因，研究可變剪下，融合基因事件和在轉錄水平上進行性狀定位等。轉錄組測序現已廣泛的應用到科研基礎研究，臨床疾病研究和藥物研發等領域。

常規轉錄組測序根據實驗樣品的不同可分為真核生物轉錄組測序和原核生物轉錄組測序；根據建庫時的方法和研究目的不同可分為鏈特異性轉錄組建庫和非鏈特異性轉錄組建庫；根據測序物種有無參考基因組可以分為有參基因組轉錄組測序和無參基因組轉錄組測序。 技術路線   有參考基因組的轉錄組測序

 

無參考基因組的轉錄組測序

技術優勢   

測序策略   

 

測序策略	PE100或PE150
建議資料量	真核生物：一般測序5-6G深度測序10G 原核生物：一般測序1G深度測序5-10

 

收樣要求   

組織	500mg新鮮植物樣本，300mg新鮮動物樣本注: 腫瘤組織優先選擇RNAlater儲存
細胞	>5*106懸浮/貼壁細胞
血液	>3ml全血/全血分離的有核細胞
RNA總量	>3 μg，濃度 >50ng/μl, RIN值>6.5
對於較難進行取材的醫學類樣品，可以適當降低樣本標準。

 

 

您可以得到的資料分析   有參非鏈特異性轉錄組生物資訊學分析流程

 

常規分析	進階分析
高通量序列與參考基因組比對 測序資料質控分析 基因表達量分析 基因的可變剪下分析（真核生物） 基因結構最佳化及新轉錄本預測 SNP、InDel等基因結構變異篩查 樣本間基因差異表達分析 差異表達基因的KEGG和GO功能分析	差異基因的蛋白互作分析 個人化定製分析

 

  

 

無參（de novo）非鏈特異性轉錄組生物資訊學分析流程

 

 

常規分析	進階分析
測序資料質控分析 參考序列拼接 Unigene的長度統計及功能注釋 Unigene的表達譜構建 SSR分析 ORF預測 SNPs分析 序列資訊統計 Unigene在樣本之間各類差異基因表達 Unigene的KEGG和GO功能分析	差異基因的蛋白互作分析 個人化定製分析

 

案例解析   

利用腫瘤血小板RNA-seq發現直接利用血液在分子通路層面上診斷

泛癌症、分辨不同癌症類型和評鑑癌症基因突變的方法

(有參轉錄組測序)

腫瘤相關的血小板（Tumor-educated platelets, TEPs）在全身或病灶範圍上會根據腫瘤的生長情況而改變自身mRNA的表達。本研究對228個原發腫瘤或腫瘤轉移患者和55個健康個體血液中的血小板細胞進行了轉錄組測序，欲驗證腫瘤血小板中mRNA的變化是否能指導癌症的診斷和分類。測序後，通過序列比對，共評鑑出5,003個已知的血小板mRNA生物標記，例如B2M, PPBP, TMSB4X, PF4等，同時也評鑑出了一些非編碼RNA（lncRNAs）。

癌症患者與健康個體相比，1,453種mRNA表達量提高，793種mRNA表達量下降。群集結果顯示癌症患者與健康個體的血小板細胞mRNA資訊有較大差異。隨後，課題組基於差異表達基因，利用不同演算法對6種不同的癌症類型進行診斷和區分，結果顯示可達到較好的癌症分辨效果。

本研究通過對血小板細胞進行轉錄組測序，發現了基於腫瘤相關血小板細胞中mRNA的資訊對腫瘤進行早期診斷和癌種區分的方法。

 

Best, Myron G., et al. "RNA-Seq of tumor-educated platelets enables blood-based pan-cancer, multiclass, and molecular pathway cancer diagnostics."Cancer cell(2015): 666-676.（Imapct factor：27.407）

 

 

A. 測序後分析5,003個mRNA的上下調錶達情況（紅色代表上調基因，藍色代表下調基因）

B.健康個體和腫瘤患者mRNA表達量差異熱圖（上方橫條中紅色代表健康個體，灰色代表腫瘤患者）

 

蠑螈不同組織de Novo轉錄組測序評鑑與肢臂重生相關mRNA與其編碼的蛋白質

(無參轉錄組測序)

哺乳動物的肢體再生能力非常有限，蠑螈卻可以重生自身肢臂。對蠑螈再生肢臂的機制的理解並不透徹，其中一個重要的原因是蠑螈基因組巨大且不完整。本研究對蠑螈16種不同組織（包括肢臂胚芽組織、睾丸、肌肉、卵巢等）的共42個樣品進行轉錄組測序，並de novo拼接測序資料，繪製出了一個近乎於蠑螈全轉錄組的圖譜 （完整率高達88%）。同時，通過對比分析肢臂再生組織和其他組織的mRNA測序資料和表達情況，並結合先前文獻，評鑑出了在肢臂再生中特異性表達的轉錄本和其編碼的蛋白；CIRBP和KAZALD1蛋白。本研究除完成高完整度的蠑螈全轉錄組圖譜構建及注釋外，還揭示了在蠑螈進行肢體重生中的重要基因，極大地填補了蠑螈肢體再生研究的空白，並為再生醫學研究奠定了基礎。

 

Bryant, Donald M., et al. "A tissue-mapped axolotl de novo transcriptome enables identification of limb regeneration factors."Cell reports(2017): 762-776.（Impact factor: 8.282）

 

A. 針對蠑螈16種不同組織樣本的轉錄組測序和de novo拼接流程

B. 159個在肢臂胚芽組織中富集的mRNA和在各種組織中的表達熱圖，標黃的基因代表預測為可能與肢臂再生相關的基因

研究趨勢與研究熱點   

尋找研究對象的重要性狀、表型或生物標誌物；

構建研究對象在不同的處理條件下，或者不同表型研究對象的基因表達譜。尋找表達差異大的關鍵基因；

研究對象時序性或空間特異性變化的主控因素；

無參考基因組物種的基因表達譜構建；

研究近緣物種之間的進化差異等。

常見問題   在進行轉錄組測序之後，可以通過哪些方法對目標轉錄本進行驗證？
在進行轉錄組測序後，生物資訊學分析會展現出不同樣品中差異較大或有特殊意義的轉錄本，為了對這些有意義的轉錄本進行驗證和繼續研究，qRT-PCR方法可通過對目標轉錄本的表達進行定量或定性驗證。除此之外，還有Northern Blot，FISH（熒光原位雜交）和免疫熒光實驗等方法也可用於測序結果驗證。

轉錄組一般要測多大的資料量才合適？
轉錄組測序所需要的測序量要根據多個因素考量確定，這些因素包括了待測物種轉錄組大小，待測物種轉錄組中基因的數量和各類基因的丰度。不同的物種在以上因素的變化可能不同，因此為了保證資料分析結果的可靠性和準確性，我們建議客戶一定要在測序之前對待測物種的轉錄組的大小進行評估。對於有參考基因組的物種，可以根究先前的經驗，分析基因組資訊、編碼基因個數、堿基數及丰度進行預測評估。大部分物種的測序量以6-8G為佳。而多倍體植物，例如八倍體小麥這類基因組較大且複雜的物種來說，我們推薦適當增加測序量至10-12G。

轉錄組測序的資料品質影響因素主要有哪些？

轉錄組測序的品質可能會受到以下因素的影響：（1）RNA嚴重的降解可能會影響建庫與測序的品質 （2）過低的RNA起始量可能會影響建庫與測序品質，可以通過適當地增加PCR迴圈數來解決 （3）轉錄組中基因丰度的較大差異可能會影響基因檢測的解析度，高丰度的基因可能會掩蓋低丰度表達的基因。

非鏈特異性轉錄組測序