µOR(µ-opioid receptor)–Gi複合物的結構_nature2018_Antoine Koehl, Hongli Hu, Shoji Maeda等

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#原文標題、作者、期刊Structure of the μ-opioid receptor–Gi protein complex

• Antoine Koehl,
• Hongli Hu,
• Shoji Maeda,
• Yan Zhang,
• Qianhui Qu,
• Joseph M. Paggi,
• Naomi R. Latorraca,
• Daniel Hilger,
• Roger Dawson,
• Hugues Matile,
• Gebhard F. X. Schertler,
• Sebastien Granier,
• William I. Weis,
• Ron O. Dror,
• Aashish Manglik,
• Georgios Skiniotis 
• Brian K. Kobilka 

Nature volume 558, pages 547–552 (2018)

 

#總結

#本文前置：Structural insights into μ-opioid receptor activation.　　Nature volume 524, pages 315–321 (20 August 2015)

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本文包含

　　摘要 - 1

　　結論 - 5

　　方法 - 9

　　圖 - 5

　　延伸資料　　圖 - 8 ，表 - 2

 

μOR(μ-opioid receptor)–Gi複合物的結構

 

摘要

Gi : adenylyl cyclase-inhibiting heterotrimeric G protein　　腺苷酸環化酶抑制型異源三聚體G蛋白

DAMGO : [D-Ala2, N-MePhe4, Gly-ol]-enkephalin　　H-Tyr-D-Ala-Gly-N-MePhe-Gly-OH　　N→C　　最後一位甘氨酸羰基被羥基取代

　　1、本文得到了冷凍電鏡下，3.5?水平的 μOR-DAMGO 和 μOR-Gi(無核酸) 的結構。

　　2、DAMGO 佔據了嗎啡喃配體口袋，N端與受體的保守殘基互作，C端參與阿片類配體選擇的重要地區。

　　3、將 μOR-Gi 複合物與之前已經確定結構的 GPCRs-Gs 比較，得到了兩個不同之處：

　　　　（1）TM6螺旋的位點（後文中指氨基酸的替換導致的結構變化）；

　　　　（2）G蛋白α亞基與受體核心的互作。

 

3.5 ? cryo-EM map of a μOR–Gi complex

apyrase : 三磷酸腺苷雙磷酸酶，EC 3.6.1.5 ，NTP -> NDP + Pi -> NMP + 2Pi

scFv : single-chain antibody fragment 或 single-chain variable fragment

GTPγS : GTPgammaS (GTPγS, guanosine 5‘-O-[gamma-thio]triphosphate)

　　1、DAMGO是 μOR 選擇的興奮劑腦啡肽的合成類似物，將 DAMGO-μOR 與 Gi1 異源三聚體共孵育，得到的複合物用 apyrase 去除 GDP。

　　2、Gi 連有 scFv16，scFv16-Gi 與 DAMGO-μOR 通過 scFv16 穩定，scFv16 還可抑制 GTPγS 介導的無核酸複合物的分離。

　　3、用單粒子冷凍電鏡初步獲得 μOR–DAMGO–Gi–scFv16 的三維圖，標稱解析度 3.6?。

　　4、scFv16 結合了一個包含 αN helix of Gαi and the β-propeller of Gβ 的複合平面，與 μOR–Gαi 介面距離超過 20?，並且沒有幹擾 Gα 和 Gβ 亞基的介面。(Extended Data Fig. 1)

　　5、scFv16 的訊號差異將映像解析度提升到了 3.5?。

　　6、3.5? 的條件下，μOR-DAMGO，μOR-Gi 。(Fig. 1a, b)

Activation of μOR by a peptide agonist

BU72 : small molecule morphinan agonist，通過複雜的環系統結合

Nb39 : active-state stabilizing nanobody　　In the presence of 5 μM nanobody 39 (Nb39), the affinity of the potent morphinan agonist BU72 increases from 470 pM to 16 pM. BU72 has a dissociation half-life of 140 min in the presence of Nb39. Nb39 also enhances the affinity of μOR agonists DAMGO and endomorphin-2, indicating that the effect is not limited to morphinan agonists.

　　1、之前工作已得到 2.2? 活化狀態的 μOR-BU72 晶體結構，Nb39 的晶體結構。

　　2、μOR-BU72 or μOR-DAMGO 的活化狀態配體結合口袋的結構和氨基酸定位高度相似 → μOR 以一種不變的方式識別不同結構的興奮劑。(Fig. 1c)

　　3、與 BU72 相比，DAMGO 的 N 端佔據相似的結合口袋位點，但 C 端與 ECL 距離遠 ~8??。(Fig. 1d, e)

　　4、分子動力學模擬，在 1?μs 裡DAMGO基本保持不變。（圖注中說明DAMGO頻繁返回原始位點）(Fig. 1f, Extended Data Fig 5)

　　5、DAMGO 的 N 端與 D1473.32 形成穩固的鹽橋，相同的氨基也經常與 Y3267.43 形成氫鍵。(Fig. 1e）

　　6、μOR-BU72 的晶體結構顯示出 DAMGO 的苯酚基與 H2976.52 以兩個水分子成橋，但模擬說明其中一個水分子迅速分離，穩定的配體結合需要單個水分子。這是一個 μ-/δ-/κ-OR 識別阿片類的標誌。(Extended Data Fig. 6)

　　7、DAMGO 結合 μOR 比另兩種的選擇性強 500 倍，選擇性在 μ-/δ-OR 主要取決於 ECL1 的殘基，κ-OR 主要為 ECL3。

　　8、DAMGO 的 C 端圖密度較 N 端稍弱，與模擬結果相應。(Fig. 1f, Extended Data Fig 5)

　　9、DAMGO 的 N(Me)Phe side chain 佔據一個 ECL1 附近保守的疏水口袋，甘氨酸羥基回折向配體，這個模型和 μOR 與環形腦啡肽高度親和一致。(Fig. 1e)

Structure of Gi-stabilized active μOR

　　1、相對於非活化狀態，μOR-Gi 和以 Nb39 固定的 μOR-BU72 具有相似的 TM6 的向外位移（均方根偏差 1?）。(Fig. 2a, b)

　　2、大部分 GPCR 中大量的高度保守的殘基表現出對受體啟用的重要性，包括 D3.49R3.50Y3.51, N7.49P7.50XXY7.53，以及三核心 （I3.40, P5.50, F6.44）。這些結構在 μOR-Gi 中與 Nb39-μOR 複合物幾乎完全一致。(Fig. 2c)

　　3、Nb39 和 Gi 促進興奮劑親和度的上升相似，提供了一個胞內G蛋白偶聯域和配體結合口袋之間的變構通訊。

　　4、兩個 Nb39 和 Gi 結合的活化狀態 μOR 的不同特別值得注意：

　　　　（1）與納米抗體結合的活化 μOR 相比，與 μOR-Gi 複合物中 TM6 向 TM7 位移 3??。(Fig. 2b)

　　　　（2）ICL3 的結構不同。Nb39 結合的 μOR 的特殊 ICL3 結構反映了納米抗體與 μOR 與眾不同的互作，相似的 ICL3 結構的不同在與 Nb80 和 Gs 互作的 β2-adrenergic receptor (β2AR) 中存在。(Fig. 2b)

　　5、與 G 蛋白結合的狀態下，β2AR 的 TM6 比 μOR 向外移動 9??。(Fig. 2d)

Structural changes in Gi

 

Structural insights into Gi-coupling specificity of the μOR

 

 

方法

Purification of μOR

 

Expression and purification of heterotrimeric Gi

 

Generation of scFv16

 

Formation and purification of the μOR-Gi-scFv16 complex

 

Cryo-EM and 3D reconstructions of μOR-Gi-scFv16 complex

 

Model building and refinement

 

System setup for molecular dynamics simulations

 

Molecular dynamics simulation protocols

 

Analysis protocols for molecular dynamics simulation

 

 

 

 

 

 

 

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