單細胞參考文獻 single cell

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許多分析軟體 ：

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Smart-seq、CEL-seq、SCRB-seq和Drop-seq。
Smart-seq
SMART（Switching mechanism at 5’ end of the RNA transcript）是一個具有裡程碑意義的重要技術。實際上，能夠從單細胞產生全長cDNA的測序方案並不多，Smart-seq就是其中之一。對於等位基因特異性表達或者剪接變體研究來說，覆蓋整個轉錄組是一件非常重要的事情。
Fluidigm C1單細胞製備系統能夠自動完成Smart-seq步驟。你只需要將製備好的細胞懸液加進去，儀器就會分離並裂解細胞，把mRNA逆轉錄為cDNA，再對cDNA進行擴增。擴增後的cDNA可以拿來測序，也可以進行qPCR檢測。
在Enard的比較研究中，Fluidigm C1系統的Smart-seq最為靈敏，成本也最高。這一系統使用的微流體晶片不能重複使用，不過這種晶片可以放到顯微鏡下觀察，證實健康單細胞的存在。
CEL-seq
CEL-seq（Cell expression by linear amplification and sequencing）是一種採用線性擴增的常用測序方法。線性擴增的主要優勢是錯誤率比較低，不過線性擴增和PCR都存在序列依賴性偏好。
CEL-seq技術發表於2012年，主要是分離單細胞，逆轉錄帶有poly-A 尾巴的mRNA片段，給它們貼上代表其細胞來源的條碼。2014年Science雜誌發布的MARS-seq與CEL-seq很類似。
CEL-seq和其他線性擴增方法產生文庫花費的時間要稍微長一點。不過，CEL-seq在早期階段就給樣本貼上條碼並進行混合，大大減少了手動操作的時間。PCR是在最後階段使用的，主要是為了串連正確的測序接頭，CEL-seq開發人員紐約大學的Itai Yanai介紹到。
CEL-seq所需試劑都是現成的，大約兩天時間產生測序文庫和測序資料，Yanai指出。需要注意的是，CEL-seq與大多數方案一樣，測序轉錄本的3’端。Enard等人並沒有親自嘗試著一技術，只是在比較研究中用到了CEL-seq資料。從這項研究來看，CEL-seq的重現性最好。
GitHub網站提供有CEL-seq可用的生物資訊學工具。Yanai研究團隊正在開發新版本CEL-seq2，新版本的靈敏度將比舊版本高三倍。
SCRB-seq
Broad研究所開發的SCRB-seq（single-cell RNA barcoding and sequencing）技術採用的是PCR擴增。該技術需要結合流式細胞儀（FACS）或者其他細胞分選方法，把單細胞分配到微孔裡去。
SCRB-seq與Smart-seq比較相似，只不過SCRB-seq會整合特異性的細胞條碼，以分辨擴增分子的來源，更準確的定量轉錄本。此外，SCRB-seq並不產生全長cDNA，而是像CEL-seq一樣富集RNA 3’端。
2014年，開發人員們將SCRB-seq技術提前發布在BioRXiv上。隨後他們對這一技術進行了更新，並將其更名為“high-throughput eukaryote 3’ digital gene expression”。Broad研究所仍提供有SCRB-seq技術服務，SCRB-seq也被整合到了Wafer GenBio systems公司的scRNA-seq平台上。據說Fluidigm公司的C1系統很快也將支援SCRB-seq方案。SCRB-seq目前是Enard最中意的測序方法，它不僅適用於單細胞RNA測序，還能支援大量細胞（bulk）的RNA測序。可惜的是SCRB-seq並不好DIY，研究者自己很難將測序流程與FACS對接起來。
DROP-seq和inDROP
哈佛醫學院的研究人員開發了以微滴為基礎的兩種獨立技術Drop-seq和inDrop。他們利用微流體裝置將帶有條碼的微珠和細胞一起裝入微小的液滴，建立了快速、廉價、高通量的單細胞RNA-seq方法。這兩種技術將細胞隔離在微小的液滴中，裝上用於擴增的條碼引物，由此檢測數以千計的細胞。研究者們認為，Drop-seq和inDrop能夠協助生物學家進一步發現和分類人體細胞，繪製大腦等複雜組織的細胞多樣性圖譜，更好地瞭解幹細胞分化，獲得更多疾病的遺傳學資訊。
Enard及其同事發現，Drop-seq在單個細胞中檢測的基因數還不到Smart-seq/C1、CEL-seq和SCRB-seq的一半。不過，在統計學水平上研究差異性表達的時候，高通量Drop-seq和SCRB-seq是最划算的。哈佛醫學院Steve McCarroll實驗室去年下半年根據使用者反饋，在自己網站上公布了3.1版的Drop-seq（mccarrolllab.com/dropseq）。
參與開發SCRB-seq的Stefan Semrau正在搭建自己的Drop-seq平台。Semrau從Whitehead生物醫學研究所搬到Leiden物理研究所的時候，發現自己用FACS已經不那麼方便了，於是他為新實驗室選擇了Drop-seq。建立微流體晶片和液滴系統是整個過程中最艱難的部分，不過Semrau實驗室的一名微流體博士後僅用三周就搞定了這些問題。Drop-seq文庫製備是任何分子生物學研究者都熟悉的標準操作。據Semrau估計，搭建和最佳化Drop-seq大概只需要六個月時間。
四種單細胞RNA-seq方法比較

 

 

 

 

 Synthesising Executable Gene Regulatory Networks from Single-Cell Gene Expression Data

https://link.springer.com/chapter/10.1007/978-3-319-21690-4_38

 

Decoding the Regulatory Network for Blood Development from Single-Cell Gene Expression Measurements

https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC4374163/

 

 

綜述Computational and analytical challenges in single-cell transcriptomics

https://www.nature.com/articles/nrg3833

Bioinformatics approaches to single-cell analysis in developmental biology.

https://academic.oup.com/molehr/article-lookup/doi/10.1093/molehr/gav050

https://academic.oup.com/molehr/article/22/3/182/2459767

Single-cell sequencing in stem cell biology

Lu WenEmail author andFuchou TangEmail author
Genome Biology201617:71
DOI: 10.1186/s13059-016-0941-0
? Wen and Tang. 2016
Published: 15 April 2016

 

 Application of single-cell genomics in cancer: promise and challenges

 

 

scale of Single cell data

http://bix.ucsd.edu/projects/singlecell/nbt_data.html

http://bioinformatics.oxfordjournals.org/content/early/2016/04/18/bioinformatics.btw201

Single-cell RNA-sequencing: The future of genome biology is now.

http://www.tandfonline.com/doi/full/10.1080/15476286.2016.1201618?scroll=top&needAccess=true

A survey of best practices for RNA-seq data analysisSingle-cell genomics: coming of ageSINGLE CELL GENE EXPRESSION FOR DIAGNOSIS, PROGNOSIS AND IDENTIFICATION OF DRUG TARGETS

 

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